Моделирование острого панкреатита у крыс
Изобретение относится к области медицины, в частности к экспериментальной хирургии. Способ позволяет разработать модель, наиболее оптимально соответствующую патогенетическим механизмам развития острого деструктивного панкреатита у человека. Вводят в общий желчный проток соли желчных кислот, при этом в него 0,3 мл буферного раствора, содержащего 0,3 г трис-гидроксиметил-аминометана и 0,6 г дезоксихолата натрия в 100 мл с рН 8,8, со скоростью потока 0,07 мл в минуту и регулируют площадь панкреонекроза наложением лигатур выше или ниже места впадения дополнительного протока поджелудочной железы. 8 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования острого деструктивного панкреатита у крыс.
Близким решением является способ моделирования, разработанный Aho HJ, Koskensalo SM, и Nevalainen TJ, описанный в статье Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol 15: 411-416, 1980. Который заключается в трансдуоденальной катетеризации общего желчного протока и введение таурохолата натрия (0,4 мл 4% раствора) в общий желчный проток и протоки поджелудочной железы.
При использовании данного способа моделирования острого деструктивного панкреатита патогенетические механизмы, лежащие в основе большого количества летальных исходов, отличаются от таковых при развитии острого панкреатита в клинике. Так, таурохолат, являясь гемолитическим ядом, при применении в вышеуказанных концентрациях вызывает внутрисосудистый гемолиз. Другим отрицательным свойством данной модели является невозможность влияния на площадь панкреонекроза. Немаловажным фактором, влияющим на интрапанкреатическую активацию ферментов поджелудочной железы, является уровень рН в ее протоковой системе, что никак не учитывается в данной модели.
Задачей изобретения является разработка модели острого панкреатита, наиболее оптимально соответствующей патогенетическим механизмам, имеющим место при развитии острого панкреатита у человека, позволяющей регулировать площадь панкреонекроза, а также снижение летальности, обусловленной гемолитическим действием вводимого в протоки раствора.
Поставленная задача решаются тем, что для моделирования острого деструктивного панкреатита вместо раствора таурохолата натрия мы используем трансдуоденальное внутрипротоковое введение специальной буферной системы, содержащей соль желчной кислоты при оптимальной для интрапанкреатической активации ферментов рН. Для возможности управления площадью панкреонекроза мы используем различное наложение (дистальнее или проксимальнее места впадения добавочного протока поджелудочной железы в общий желчный проток) лигатуры, что обеспечивает развитие тотального или субтотального панкреонекроза.
Изобретение поясняется фигурами:
— на фиг.1 изображено строение протоковой системы крысы (1);
— на фиг.2 изображено строение протоковой системы крысы (2);
— на фиг.3 изображен первый этап моделирования (срединная лапаротомия);
— на фиг.4 изображен второй этап моделирования (выведение органов в рану);
— на фиг.5 изображен третий этап моделирования (пункция двенадцатиперстной кишки и катетеризация общего желчного протока);
— на фиг.6 изображен пример наложения турникетов для воспроизведения субтотального панкреонекроза;
— на фиг.7 изображен пример наложения турникетов для воспроизведения тотального панкреонекроза;
— на фиг.8 изображен пятый этап моделирования — ушивание лапаротомной раны.
Способ осуществляется следующим образом.
Операция проводится с соблюдением правил асептики и антисептики под эфирным наркозом. После обработки операционного поля послойно вскрывается брюшная полость (верхнесрединная лапаротомия) на протяжении 2-3 см (фиг.3). Операционное поле отгораживается стерильными салфетками.
При вскрытии брюшной полости в рану выводится петля двенадцатиперстной кишки (фиг.2. 12, фиг 4). В гепатодуоденальной связке определяется общий желчный проток крысы диаметром 0,3-0,5 мм (фиг.2. 11, фиг.4. 16 ). На расстоянии приблизительно 1,5 см от ворот печени (фиг.2. 10) в общий желчный проток по задней поверхности впадает главный панкреатический проток (фиг.2. 9), который собирает секрет от желудочной и селезеночной частей поджелудочной железы и имеет диаметр приблизительно около 0,2-0,3 мм, что лучше видно при рассечении связки аналоги lig. gastrocolicum и отведении желудка кверху (фиг.1). При этом мы увидим дистальную часть общего желчного протока (фиг.1. 2), впадающий в него главный панкреатический проток (фиг.1. 3), желудочную часть поджелудочной железы (фиг.1. 7), прилежащую к задней стенке желудка (фиг.1. 4), и селезеночную часть поджелудочной железы (фиг.1. 6), прилежащую к воротам селезенки (фиг.1. 5). Также при этом доступе можно увидеть и дуоденальную часть поджелудочной железы (фиг.1. 8), дренирующуюся дополнительным протоком (фиг.1. 1), который впадает в общий желчный проток по задней его поверхности на расстоянии около 0,5 см от места вхождения общего желчного протока в стенку двенадцатиперстной кишки. Место впадения дополнительного панкреатического протока в общий желчный проток можно увидеть и при выведении ДПК, как это показано на фиг.2. 19. Интрамуральный отдел общего желчного протока (фиг.2. 14) открывается в просвет ДПК, что можно увидеть через стенку кишки (фиг.2. 14, фиг.4. 17). Найдя место впадения общего желчного протока от него отступают около 0,5 см в этом месте производят пункцию двенадцатиперстной кишки зондом, диаметром 0,3 мм (фиг.5. 19), который через большой дуоденальный сосочек проводится в общий желчный проток до середины расстояния между местами впадения панкреатических протоков (фиг.5. 19). После этого на общий желчный проток накладывается два турникета. Один выше места впадения основного панкреатического протока (фиг.6. 20, фиг.7. 22), второй, в зависимости от того, какую форму панкреатита необходимо воспроизвести (тотальную или субтотальную), выше (фиг.6. 21) или ниже (фиг.7. 23) места впадения добавочного протока поджелудочной железы. Турникеты затягивают. В проток при помощи насоса для микроинфузий вводят 0,3 мл буфера (содержащего 0,3 г трис-гидроксиметил-аминометана и 0,6 г дезоксихолата натрия в 100 мл при рН 8,8) при скорости потока 0,07 мл в минуту. Турникеты с протоков снимают спустя минуту после прекращения введения буфера и удаляют катетер из протока.
После создания модели органы погружаются в брюшную полость. Убираются отгораживающие салфетки. Брюшная полость послойно ушивается отдельными шелковыми швами (фиг.8). Рана обрабатывается раствором антисептика.
Пример конкретного применения.
Исследование проведено на 100 самках крыс линии Вистар массой 200 г. С целью подтверждения наличия острого деструктивного панкреатита производилось морфологическое исследование образцов поджелудочной железы на сроке 12 часов (как наиболее информативного срока). Образцы поджелудочной железы забирались, фиксировались в 10% растворе нормального формалина, обезвоживались, заливались в парафин, готовились парафиновые срезы, которые затем окрашивались гематоксилин-эозином. Также производилось исследование активности амилазы в сыворотке крови и перитонеальном экссудате амилокластическим методом со стойким крахмальным субстратом по Каравею. Кроме этого оценивалась летальность за первые сутки с момента моделирования. Полученные данные сравнивали с данным контрольной группы (интактные животные).
Так, нормальные значения активности амилазы, вычисленные для нашей лаборатории, — 61,76 г/ч/л.
После моделирования острого панкреатита описанным выше методом через 12 часов с момента моделирования активность амилазы сыворотки крови при тотальном панкреонекрозе достигает уровня 144,77±3,2 г/ч/л (р<0,01), а перитонеального экссудата 1237,36±7,4 г/ч/л (р<0,01) г/ч/л, при субтотальном панкреонекрозе 160,56±4,3 г/ч/л (р<0,01) и 1548,21±8,3 г/ч/л (р<0,01) — соответственно.
При морфологическом исследовании получены следующие результаты:
Макроскопическая картина при вскрытии брюшной полости и грудной клетки крысы после моделирования тотального панкреонекроза.
При вскрытии в брюшной полости до 5 мл серозно-геморрагического выпота во всех отделах, гиперемия париетальной и висцеральной брюшины брыжейка тонкой кишки отечна, с множественными мелкими очагами стеатонекроза.
Печень не увеличена, темно-вишневого цвета, поверхность ее гладкая, края долей заострены. Почки без видимой макроскопической патологии. Селезенка умеренно увеличена в размерах, темно-вишневого цвета. При вскрытии просвета желудка и ДПК определяются множественные мелкие (точечные) эрозии шоколадного цвета.
Поджелудочная железа резко отечна с участками стеатонекроза размерами от 0,3 до 0,5 см в диаметре. В области желудочно-дуоденальной части имеются участки геморрагического панкреонекроза размерами до 0,3 см в диаметре. Отмечается отек забрюшинной клетчатки.
При вскрытии грудной клетки определяется гиперемия плевры и небольшое количества светлого выпота. Поверхность легких гладкая, буроватого цвета с множественными точечными кровоизлияниями. Сердце без видимых макроскопических изменений.
Морфологическое исследование поджелудочной железы (окраска гематоксилин-эозином увеличение 2015) при моделировании субтотального панкреонекроза.
В дуоденальной части определяется зона тотального некроза с участками геморрагии, массивной нейтрофильно-макрофагальной инфильтрацией. Структура ацинусов не сохранена.
В желудочной части имеет место крупноочаговый панкреонекроз с единичными участками геморрагии, клеточными структурами разрушенных панкреатоцитов, нейтрофильно-макрофагальной инфильтрацией. В зонах, удаленных от очагов некроза, структура ацинусов сохранена. В участках, примыкающих к зонам некроза, панкреатоциты имеют вакуолизированную цитоплазму, ядра неправильной формы.
В селезеночной части определяются множественные центролобулярные некрозы. Имеется значительное количество ацинусов с сохраненной структурой, встречаются интактные островки Лангерганса.
Макроскопическая картина при вскрытии брюшной полости и грудной клетки крысы после моделирования субтотального панкреонекроза.
При вскрытии брюшной полости определяется до 3-4 мл серозно-геморрагического выпота. Париетальная и висцеральная брюшина гиперемирована во всех отделах. Брыжейка тонкой кишки отечна, с умеренным количеством мелких очагов стеатонекроза. Печень не увеличена, темно-вишневого цвета, поверхность ее гладкая, края долей заострены. На разрезе структура паренхемы не изменена, сосуды полнокровны. Селезенка умеренно увеличена в размерах, темно-вишневого цвета. Почки увеличены серовато-бурого цвета, на разрезе отчетливо просматривается кортикальный слой, темно-вишневого цвета с серым оттенком. При вскрытии просвета желудка и ДПК определяются множественные мелкие эрозии шоколадного цвета.
Поджелудочная железа резко отечна с участками стеато и геморрагического панкреонекроза в желудочной части до 0,3 см в диаметре и участками стеатонекроза в парапанкреатической клетчатке. Дуоденальная часть железы отечна.
При вскрытии грудной клетки определяется гиперемия плевры и небольшое количества светлого выпота. Поверхность легких гладкая, буроватого цвета с множественными точечными кровоизлияниями.
Сердце без видимых макроскопических изменений.
Морфологическое исследование поджелудочной железы (окраска гематоксилин-эозином увеличение 2015) при моделировании субтотального панкреонекроза.
В дуоденальной части определяется интерстициальный отек с геморрагическим пропитыванием. Структура ацинусов сохранена. В желудочной части имеет место крупноочаговый панкреонекроз с единичными участками геморрагий, клеточными структурами разрушенных панкреатоцитов, нейтрофильно-макрофагальной инфильтрацией. В зонах, удаленных от очагов некроза, структура ацинусов сохранена. В участках, примыкающих к зонам некроза, панкреатоциты имеют вакуолизированную цитоплазму, ядра неправильной формы.
В селезеночной части определяются множественные центролобулярные некрозы. Имеется значительное количество ацинусов с сохраненной структурой, встречаются интактные островки Лангерганса.
При моделировании острого панкреатита летальность к первым суткам составила 80,6% при тотальном панкреонекрозе и 56,3% при субтотальном панкреонекрозе.
В образцах крови, взятых при тотальном и при субтотальном панкреонекрозе, гемолиза не выявлено.
Таким образом, поставленная задача достигнута, во первых, за счет уменьшения количества желчной кислоты в водимом в протоки растворе, во вторых, за счет поддержания рН вводимого раствора на оптимальном для активации ферментов уровне, в третьих, за счет наложения турникета до или после места впадения дополнительного протока поджелудочной железы в общий желчный проток и управления площадью некроза.
В результате применения данного способа моделирования острого панкреатита развивается крупноочаговый некроз поджелудочной железы (тотальный или субтотальный), что, в свою очередь, приводит к:
1. Выявлению достоверных признаков развития острого панкреатита (морфологических и биохимических).
2. Возможности управления площадью некроза.
3. Снижению уровня летальности, связанной с гемолитическим действием солей желчных кислот.
Формула изобретения
Способ моделирования острого деструктивного панкреатита у крыс, включающий введение в общий желчный проток соли желчных кислот, отличающийся тем, что в общий желчный проток вводят 0,3 мл буферного раствора, содержащего 0,3 г трис-гидроксиметил-аминометана и 0,6 г дезоксихолата натрия в 100 мл с рН 8,8, со скоростью потока 0,07 мл в минуту и регулируют площадь панкреонекроза наложением лигатур выше или ниже места впадения дополнительного протока поджелудочной железы в общий желчный проток.
РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8
Источник
Аннотация:
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования острого панкреатита различной степени тяжести у крыс. Осуществляют введение в общий желчный проток соли желчных кислот. Соли желчных кислот вводят без канюлизации большого сосочка двенадцатиперстной кишки. При моделировании острого панкреатита средней степени тяжести накладывают турникеты на общий желчный проток выше и ниже места впадения дистального протока поджелудочной железы. В общий желчный проток вводят 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг, а затем перевязывают через 15 минут дистальный проток поджелудочной железы и снимают турникеты. При моделировании острого панкреатита тяжелой степени тяжести накладывают два турникета на общий желчный проток выше места впадения дистального протока поджелудочной железы и ниже места впадения проксимального протока добавочной доли поджелудочной железы. При этом вводят 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг и через 15 минут перевязывают оба протока поджелудочной железы крысы. Способ обеспечивает повышение вероятности удачной повторяемости результатов воспроизведения модели острого панкреатита различной степени тяжести у крыс за счет учета обструкции протоковой системы поджелудочной железы крыс и этиологического критерия развития острого панкреатита. 8 ил., 2 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования острого панкреатита у крыс.
Близким решением является способ моделирования, разработанный Р.А. Емельяновым, С.А. Алехиным, Д.П. Назаренко, М.В. Покровским, Т.Г. Покровской, Е.Б. Артюшковой, М.П. Гладченко, описанный в статье Исследование микроциркуляции методом лазердоплеровской флуометрии при остром экспериментальном панкреатите. Кубанский научный медицинский вестник от 30.11.2006 г. Стр. 50-52 г., где для моделирования острого деструктивного панкреатита вместо раствора таурохолата натрия, описанного Aho HJ, Koskensalo SM, и Nevalainen TJ в статье Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis. Scand J Gastroenterol 15: 411-416, 1980 г., используется трансдуоденальное внутри-протоковое введение специальной буферной системы, содержащей соль желчной кислоты при оптимальной для интрапанкреатической активации ферментов рН. Для возможности управления площадью панкреонекроза использовали различное наложение (дистальнее или проксимальнее места впадения добавочного протока поджелудочной железы в общий желчный проток) лигатуры, что обеспечивать развитие тотального или субтотального панкреонекроза.
При использовании данного способа моделирования острого деструктивного панкреатита не учитывалась обструкция протоковой системы поджелудочной железы крыс, этиологический критерий развития острого панкреатита, лежащие в основе большого количества летальных исходов, отличаются от таковых при развитии острого панкреатита в клинике.
Техническим результатом изобретения является повышение вероятности удачной повторяемости результатов воспроизведения модели данного заболевания.
Технический результат достигается тем, что для моделированияострого панкреатита вместо специальной буферной системы мы используем 50% раствор желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг с последующим его введением в общий желчный проток, без канюлизации большого дуоденального сосочка. Для возможности управления степенью тяжести и площадью поражения поджелудочной железы мы используем этапное наложение турникетов на места впадения добавочных протоков поджелудочной железы и общий желчный проток, что обеспечивает развитие острого панкреатита различной степени тяжести.
Изобретение поясняется фигурами:
— фиг. 1 — Вскрытие брюшной полости крысы.
— фиг. 2 — Демонстрация забора желчи.
— фиг. 3 — Моделирование острого панкреатита средней степени тяжести.
— фиг. 4 — Моделирование острого панкреатита тяжелой степени тяжести.
— фиг. 5 — Микрофото: крупные участки деструкции ткани в виде обширных бесструктурных эозинофильных очагов некроза с выраженной перифокальной воспалительной инфильтрацией преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами. Окр. Гематоксилином и эозином (х 100).
— фиг. 6 — Микрофото: некротические изменения распространились на парапанкреатическую клетчатку с ее воспалительной инфильтрацией. Окр. Гематоксилином и эозином (х 100).
— фиг. 7 — Микрофото: в близи очагов некроза, выраженный интерстициальный отек. Окр. Гематоксилином и эозином (х 100).
— фиг. 8 — Микрофото: в близи очагов некроза, выраженный интерстициальный отек. Окр. Гематоксилином и эозином (х 200).
Способ осуществляется следующим образом.
При вскрытии брюшной полости (фиг. 1) в рану выводится петля двенадцатиперстной кишки (фиг. 1. 2). В гепатодуоденальной связке определяется общий желчный проток крысы (фиг. 1. 3) диаметром 0,27- 0,57 мм. На расстоянии приблизительно 1,5 см от ворот печени в общий желчный проток по задней поверхности впадает дистальный панкреатический проток диаметром приблизительно около 0,2-0,3 мм, что лучше видно при рассечении связки аналоги lig. gastrocolicum и отведении желудка (фиг. 1. 1). При этом мы увидим общий желчного проток, впадающий в него дистальный панкреатический проток (фиг. 1. 4), часть поджелудочной железы, прилежащую к задней стенке желудка и к воротам селезенки. При данном доступе можно увидеть дуоденальную часть поджелудочной железы, дренирующуюся дополнительным протоком добавочной долей поджелудочной железы (фиг. 1. 5), который впадает в общий желчный проток по задней его поверхности на расстоянии около 0,5 см от места вхождения общего желчного протока в стенку двенадцатиперстной кишки. Произвели забор желчи из общего желчного протока с помощью катетера для приготовления ее 50% раствора с рН=6,0 (фиг 2.).
Отличие метода от существующих заключается в возможности моделирования ОП различной степени тяжести без канюлизации большого сосочка двенадцатиперстной кишки за счет воспроизведения модели с наложением турникетов (фиг 3. 6, фиг. 3. 7) на общий желчный проток (фиг. 3.3) выше и ниже места впадения дистального протока поджелудочной железы (фиг. 3. 4) и введения по катетеру 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг (фиг. 3. 9), с последующей перевязкой данного протока (фиг. 3. 8), в результате чего наблюдается формирование ОП средней степени тяжести (фиг. 3). Моделирование ОП тяжелой степени достигается наложением двух турникетов на общий желчный проток выше места впадения дистального протока поджелудочной железы (фиг. 4. 6) и ниже места впадения проксимального протока добавочной доли поджелудочной железы (фиг. 4. 7), введения 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг (фиг. 4. 9), с последующей перевязкой двух протоков поджелудочной железы крысы (фиг 4. 8, фиг. 4. 10). Во всех случаях перевязка протоковой системы поджелудочной железа происходит через 15 мин, затем турникеты снимаются, рана послойно ушивается.
Моделирование различных по степени тяжести форм ОП производили за 5 суток до выведения животных из эксперимента, поскольку в ранее проводимых исследованиях установлено наличие максимально выраженных метаболических изменений в крови и манифестной морфологической картины ОП именно в эти сроки. Для проведения лабораторных тестов на 5-е сутки от моделирования ОП, под наркозом, с тщательным соблюдением правил асептики и антисептики, осуществляли торакотомию и забор крови в объеме до 5 мл из правого желудочка сокращающегося сердца, с последующим выведением животных из эксперимента передозировкой средств для наркоза.
Результаты моделирования острого панкреатита различной степени тяжести.
У животных с экспериментальной моделью обструктивного панкреатита при гистологическом исследовании поджелудочной железы обнаруживались крупные участки деструкции ткани в виде обширных бесструктурных эозинофильных очагов некроза с выраженной перифокальной воспалительной инфильтрацией преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами (фиг. 5). При этом некротические изменения распространялись на парапан-креатическую клетчатку с ее воспалительной инфильтрацией (фиг. 6). В сохранившейся ткани поджелудочной железы, особенно вблизи очагов некроза, развивались выраженное полнокровие сосудов и интерстициальный отек (фиг. 7, фиг. 8).
Таким образом, при экспериментальном ОП средней и тяжелой степенях тяжести обнаружены различные по выраженности метаболические и иммунные нарушения с провоспалительной направленностью. При этом отмечается прямая зависимость выраженности иммунометаболических изменений от тяжести ОП. Установленные лабораторные сдвиги позволяют утверждать о развитии острого панкреатита у крысы.
Данный способ позволяет:
— получать высокий достоверный результат операций при минимальной гибели подопытных животных, т.е. высокая повторяемость положительных результатов;
— техническая простота и доступность операций;
— возможность протекания моделируемого заболевания в течение длительного времени до 5 и более суток, что в последующем дает возможность медикаментозного вмешательства и испытания новых лекарственных форм и препаратов для лечения и изучения их влияния.
Способ моделирования острого панкреатита различной степени тяжести у крыс, включающий введение в общий желчный проток соли желчных кислот, отличающийся тем, что соли желчных кислот вводят без канюлизации большого сосочка двенадцатиперстной кишки, при моделировании острого панкреатита средней степени тяжести накладывают турникеты на общий желчный проток выше и ниже места впадения дистального протока поджелудочной железы, в общий желчный проток вводят 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг, а затем перевязывают через 15 минут дистальный проток поджелудочной железы и снимают турникеты, а при моделировании острого панкреатита тяжелой степени тяжести накладывают два турникета на общий желчный проток выше места впадения дистального протока поджелудочной железы и ниже места впадения проксимального протока добавочной доли поджелудочной железы, при этом вводят 50% раствора желчи с рН=6,0 в дозе 0,2 мг/кг и через 15 минут перевязывают оба протока поджелудочной железы крысы.
Источник
