Модель язвы желудка на крысах
Трубицын Роман Владимирович1, Рудаков Олег Сергеевич1, Овсянников Никита Игоревич1
1Курский государственный медицинский университет, студент 5 курса лечебного факультета
Аннотация
Моделирование язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у лабораторных животных является значимым для исследования противоязвенных препаратов, процесса заживления пептических язв, а также для улучшения оценки негативных последствий применения НПВС для слизистой оболочки ЖКТ. В данной работе представлен обзор способов моделирования хронических пептических язв желудка и двенадцатиперстной кишки.
Библиографическая ссылка на статью:
Трубицын Р.В., Рудаков О.С., Овсянников Н.И. Методы моделирования ацетатных язв в экспериментальной физиологии // Современные научные исследования и инновации. 2018. № 2 [Электронный ресурс]. URL: https://web.snauka.ru/issues/2018/02/85887 (дата обращения: 27.03.2019).
Индукция язвы у лабораторных животных может осуществляться множеством способов, таких как: воздействие химическими, физическими и биологическими факторами (НПВС [1], этанолом [2], серотонином [3], культурой Helicobacter pylori [4]), нарушением поступления желчи в двенадцатиперстную кишку [5], стимуляцией секреции желудочного сока (индукция индометацином и гистамином [6]), воздействием на нервную систему (операция хронического раздражения блуждающих нервов по В. А. Иванову [5]), ишемией-реперфузией [7], лигированием привратника [8], . Однако, несмотря на множество представленных методов, наиболее оптимальным является метод моделирования хронической пептической язвы с помощью уксусной кислоты.
Существует четыре типа экспериментальных моделей язвенной болезни, индуцируемых уксусной кислотой. Они были разработаны для для исследования противоязвенных препаратов, процесса заживления пептических язв, а также для улучшения оценки негативных последствий применения НПВС для слизистой оболочки ЖКТ. Модели позволяют легко и надежно производить круглые глубокие язвы в желудке и двенадцатиперстной кишке при помощи уксусной кислоты у мышей, крыс, морских свинок, кошек, собак, свиней и обезьян.
Язвенная модель 1-го типа. Процедура начинается с лапаротомии через срединный разрез в эпигастрии крыс, наркотизированных эфирным наркозом. После выделения желудка 0,02 мл 20% раствора уксусной кислоты вводят в подслизистый слой железистой части передней стенки при помощи микрошприца (0,05 мл). В момент инъекции необходимо плотно прижать палец к введенной игле таким образом, чтобы избежать утечки раствора. После инъекции иглу вынимают, а большой палец держится в месте инъекции в течение 45 с, чтобы предотвратить утечку уксусной кислоты при удалении иглы. Точность инъекции легко подтверждается появлением волдыря в месте инъекции. Операция требует примерно 4-5 минут на одно животное. После закрытия живота крыс оставляют в живых. Затем животных умерщвляют через определенные промежутки времени, чтобы оценить заживление язвы. В течение 30 минут после инъекции поверхность слизистой оболочки желудка повреждается. Через пять дней после инъекции уксусной кислоты наблюдаются круглые или овальные глубокие язвы (примерно 50-60 мм2) в антральном отделе или в области, соответствующей месту инъекции недалеко от перекрестка антрального отдела и тела желудка. Следовательно, 5-й день после инъекции кислоты определяется в качестве первого дня язвообразования. Гистологические срезы подтверждают наличие язвы, прободающей всю стену желудка, т.е. мышечная ткань в области язвы полностью отсутствует. В подслизистом слое вокруг краев язвы часто наблюдается лейкоцитарный экссудат, отек и клеточная инфильтрация.
Язвы, полученные с этой моделью, сохраняться более 250 дней без вмешательства. Кроме того, исследования показали, что через 1,5 года после ульцерации язвы рецидивируют в 50% случаев. Недостатком данного метода является то, что после ульцерации внешняя поверхность изъязвленной области обладает высокой адгезией к печени, т.е. данные органы сцепляются между собой.
Язвенная модель 2-го типа. Является методом моделирования язвы двенадцатиперстной кишки и желудка с помощью ограниченного, фокусного воздействия 0,2 мл 100%-ной уксусной кислоты на поверхность серозной оболочки на протяжении 30-60 с. Данная модель язвообразования имеет аналогичный недостаток как у модели l-го типа, т.е. дно язвы прикрепляется к окружающим органам, в частности к печени. Сосудистые и микрососудистые изменения, которые предшествуют некрозу железистых клеток, представляют собой основной шаг в развитии язв в модели 2-го типа у крыс, вследствие чего ишемический некроз приводит к ульцерогенезу. Наконец, заслуживает внимания то, что данная модель в хронической стадии морфологически напоминает язву двенадцатиперстной кишки человека.
Язвенная модель 3-го типа. Проблема адгезии в моделях язвообразования l-гo и 2-го типа привела к необходимости исследования альтернативных методов. Антральный отдел желудка играет важную роль в поддержании целостности желудочно-кишечного тракта с помощью секреции эндогенного трофического гормона гастрина. Чтобы прийти к таким выводам, Yasuhiro Tsukimi и Susumu Okabe в эксперименте на крысах удалили всю слизистую оболочку антрального отдела путем химической абляции [2]. Три дня спустя большая часть антральной слизистой была серьезно повреждена и сывороточный уровень гастрина был значительно снижен. Эта находка позволила создать новую модель желудочной язвы с помощью внутриполостного применения раствора уксусной кислоты. Для этой цели были разработаны круглые щипцы (ID 9 мм), чтобы зажать фундальную область. Раствор уксусной кислоты вводили в зажатой части через антрум. Как и ожидалось, две глубокие круглые язвы, одна на передней стенке, а другая на задней стенке, развились в области, которая была подвергнута действию раствора уксусной кислоты. Такие язвы иногда наблюдается у людей. Дно язв такого типа не спаивается с печенью или любым другим окружающим органом. Следовательно, эта модель язвообразования более похожа на человеческую, чем модели 1-го или 2-го типа. Тем не менее, в отличие от них, модель 3-го типа полностью исцеляется за 6-8 недель после применения кислоты и рецидивы не проявляются. Эта модель может быть особенно полезна для измерения уровня кровотока слизистой методом клиренса газообразного водор0да [9].
Язвенная модель 4-го типа. Для того чтобы получить язву через внутрипросветное применение уксусной кислоты, был немного изменен 3-ий тип модели язвообразования. Во-первых, передняя и задняя стенки тела желудка зажимаются вместе при помощи пинцета, который используется для модели язвообразования 3-го типа. Затем 0,1 мл смеси из 60% уксусной кислоты и 0,2 мл воздуха вводят в просвет вместе с инъекционной иглой через дистальную часть антрального отдела, примерно на 3 мм проксимальнее привратника. Зажимается желудок горизонтально таким образом, что введенный воздух поднимается в верхнюю половину и раствор уксусной кислоты притягивается к нижней половине. Учитывая такое позиционирование, раствор уксусной кислоты контактирует только с нижней половиной зажатой слизистой, в результате развивается язва слизистой оболочки задней стенки желудка. Через 45 с смесь раствора уксусной кислоты и воздуха удаляется из желудка и брюшная полость зашивается. Спустя 3 дня после применения кислоты четко определяется глубокая круглая язва, последовательно развивающаяся в теле желудка только на задней стенке, передняя слизистая остается по существу без изменений у каждого животного [10].
Представленные модели язв весьма напоминают человеческие, как с точки зрения патологических особенностей, так и процесса их заживления. В настоящее время они используются во всем мире для фундаментальных и клинических исследований [11,12,13] .
Библиографический список
- J. L. Wallace, W. McKnight, B. K. Reuter, and N. Vergnolle, “NSAID-Induced gastric damage in rats: requirement for inhibition of both cyclooxygenase 1 and 2,” Gastroenterology, vol. 119, no. 3, pp. 706–714, 2000
- P. J. Oates and J. P. Hakkinen, “Studies on the mechanism of ethanol-induced gastric damage in rats,”Gastroenterology, vol. 94, no. 1, pp. 10–21, 1988.
- K. J. LePard and R. L. Stephens, “Serotonin inhibits gastric acid secretion through a 5-hydroxytryptamine1-like receptor in the rat,” Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol. 270, no. 3, pp. 1139–1147, 1994.
- P. C. H. Konturek, T. Brzozowski, S. J. Konturek et al., “Mouse model of Helicobacter pyloriinfection: studies of gastric function and ulcer healing,” Alimentary Pharmacology and Therapeutics, vol. 13, no. 3, pp. 333–346, 1999.
- Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. – М.: Медицина, 1971. – 346 с.
- K. Takeuchi, O. Furukawa, H. Tanaka, and S. Okabe, “A new model of duodenal ulcers induced in rats by indomethacin plus histamine,” Gastroenterology, vol. 90, no. 3, pp. 636–645, 1986
- K. Wada, Y. Kamisaki, M. Kitano, Y. Kishimoto, K. Nakamoto, and T. Itoh, “A new gastric ulcer model induced by ischemia-reperfusion in the rat: role of leukocytes on ulceration in rat stomach,” Life Sciences, vol. 59, no. 19, pp. 295–301, 1996
- H. Shay, S. A. Komarov, S. S. Fels, D. Meranze, M. Gruenstein, and H. Siplet, “A simple method for the uniform production of gastric ulceration in the rat,” Gastroenterology, vol. 5, pp. 43–61, 1945
- Okabe S, Amagase K / An overview of acetic acid ulcer models. The history and state of the art of peptic ulcer research // Biological and Pharmaceutical Bulletin; 28(8):l321-1341(2005).
- Amagase К., Okabe S. / Acetic acid ulcers: a new method for producing solitary chronic ulcers in rat stomachs by intraluminal application of acetic acid solution // lnflammoPharmacology; 1O, 385-389 (2002).
- dos Reis Lívero, F.A., da Silva, L.M., Ferreira, D.M. et al. Hydroethanolic extract of Baccharis trimera promotes gastroprotection and healing of acute and chronic gastric ulcers induced by ethanol and acetic acid. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 2016; 389:9, 985-998.
- Gupta RA, Motiwala MN. Dumore NG, Danao KR, Canjare AB. Effect of piperine on inhibition of FFA induced TLR4 mediated inflammation and amelioration of acetic acid induced ulcerative colitis in mice. J Ethnopharmacol 2015;164:239-46. Elsevier Ireland Ltd.
- Karakoyun B, Yüksel M, Ercan F, Erzik C, Yeğen BC. Alpha-lipoic acid improves acetic acid-induced gastric ulcer healing in rats. Inflammation. 2009 Feb;32(1):37-46.
Количество просмотров публикации: Please wait
Все статьи автора «Трубицын Роман Владимирович»
Источник
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и предназначено для моделирования аутоиммунной язвы желудка у крыс. Для этого осуществляют двукратное введение животному в 1 и 10 дни водно-солевого антигена, содержащего смесь гомогената аллогенной слизистой оболочки желудка в физиологическом растворе и полного адъюванта Фрейнда, при соотношении компонентов смеси 1:2. Дополнительно вводят животному на 15 день водно-солевой антиген, содержащий смесь гомогената аллогенной слизистой оболочки желудка в физиологическом растворе и неполного адъюванта Фрейнда, при соотношении компонентов смеси 1:1. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и предназначено для моделирования экспериментальной язвы желудка у крыс.
Известны различные способы моделирования язвы желудка путем внутримышечного введения преднизолона (С.М.Липовский, 1970) или путем ежедневного введения в желудок кофеина и мышьяка (К.А.Мещерская, 1970). Недостатками первого способа является постоянное, без прекращения, ежедневное внутримышечное введение преднизолона, так как после его отмены язва быстро заживает. Недостатками второго способа является длительная работа (в течение 14 дней) с ядовитым веществом (мышьяк), а также 80% гибель животных на 7-12 день после развития язвы, а сохранившиеся животные живут недолго (34-36 дней), что затрудняет проведение и интерпретацию результатов исследования в отдаленные сроки.
Очевидно, что эти способы не обеспечивают длительного по времени существования язвенного процесса, что затрудняет исследование ее многообразных патогенетических механизмов и рациональных методов лечения.
Также известен способ воспроизведения язвы желудка (S.Okabe и S.Pfeiffer., 1971), основанный на нанесении на участок наружной поверхности желудка до 0,05 мл ледяной уксусной кислоты. Данный способ значительно эффективнее предыдущих, но также имеет ряд существенных недостатков:
1) требует оперативного вмешательства — лапаротомии;
2) в 70% случаев осложняется перфорацией желудка с пенетрацией в печень или в свободную брюшную полость с развитием перитонита;
3) развитие острого ожога всех слоев желудка с развитием коагуляционного некроза;
4) развитие спаечного процесса в брюшной полости, что затрудняет дальнейшую работу.
Ближайшим аналогом предложенного способа является способ воспроизведения аутоиммунного повреждения слизистой оболочки желудка у собак (А.Е.Гельфман и др., 1969; О.Я.Гриншпун, 1969), который основан на иммунизации животных водно-солевыми антигенами аутологичной или аллогенной слизистой оболочки желудка в смеси с адъювантом Фрейнда. Метод подготовки включает в себя оперативное вмешательство — лапаротомию, резекцию 2/3 желудка с целью забора слизистой оболочки, формирование Павловского желудочка. Затем слизистую оболочку гомогенизируют в разведении 1:10 (стерильным физиологическим раствором) смешивают с адъювантом Фрейнда с последующим внутрибрюшинным введением, дважды с промежутками в 7 дней.
Этот метод имеет преимущество по сравнению с предыдущим методом, которое состоит в том, что эрозивно-язвенное поражение слизистой оболочки протекает с выраженным иммунопатологическим компонентом, что по своему клинико-анатомическому проявлению близко к язвенной болезни человека.
Однако указанный способ имеет ряд недостатков:
1) метод является травматичным, так как связан с предварительным оперативным вмешательством с целью формирования Павловского желудочка;
2) метод включает формирование Павловского желудочка у собак, что требует дополнительного времени для ухода и восстановления;
3) исследования на собаках не позволяют в достаточно полном объеме и на длительных сроках оценить результаты исследовательских работ из-за высокой себестоимости всех подготовительных и проводимых процедур с этими животными;
4) предложенный водно-солевой антиген подходит только для формирования аутоиммунного повреждения слизистой оболочки желудка у собак и не может использоваться для воздействия на крыс.
В то же время моделирование заболеваний с участием иммунного компонента на собаках, чья высокая видовая чувствительность к воздействию антигенов сопровождается 30-40% летальностью, предопределяют необходимость использования в экспериментальных моделях с иммунным компонентом крыс как наиболее выносливых животных к воздействиям антигена и более пригодных для проведения серийных исследований.
Таким образом, целью заявляемого способа является возможность использования для создания модели экспериментальной (аутоиммунной) язвы желудка крыс, что позволяет в полном объеме и на достаточном количестве животных проводить исследования язвенного поражения желудка, протекающего с участием иммунопатологического компонента, снизить финансовые затраты на содержание животных и проводимые исследовательские работы, а также не требует дополнительного персонала.
Описание предлагаемого изобретения.
Экспериментальная модель аутоиммунной язвы желудка у крыс осуществляется следующим образом.
На первом этапе осуществляется подготовка животных (крыс) для забора материала (желудок).
За 10 часов до операции и забора желудка у животных убирают корм, оставляя питье. Для иммунизации 15 крыс трехкратно достаточно забрать материал (слизистую оболочку желудка) у 5 животных.
На втором этапе осуществляют забор материала для подготовки водно-солевого антигена
Под эфирным наркозом после обработки операционного поля по Филончикову — Гроссиху производят лапаротомию, гастрэктомию. Материал (желудок) переносят в стерильную чашку Петри. Затем вскрывают желудок по большой кривизне, дважды опускают в стерильную емкость с физиологическим раствором. После чего желудок переносят в стерильную чашку Петри, где скальпелем производят забор (соскабливанием) слизистой оболочки желудка и гомогенизируют его.
На третьем этапе осуществляют подготовку водно-солевого антигена.
Полученный гомогенат слизистой оболочки желудка в соотношении 1:4 смешивают с физиологическим раствором (1 часть гомогената к 4 частям физиологического раствора) и пропускают через фильтр с целью удаления крупнодисперсных частиц ткани желудка. Полученную раствор в соотношении 1:2 смешивают с полным адъювантом Фрейнда (1 часть раствора к 2 частям полного адъюванта Фрейнда) и ресуспендируют. Также смесь в соотношении 1:1 смешивают с неполным адъювантом Фрейнда (1 часть раствора к 1 части неполного адъюванта Фрейнда) и ресуспендируют.
Перед использованием водно-солевого антигена обязательно в течение 1 минуты ресуспендируют для эффективного смешивания с адъювантом Фрейнда и образования однородной массы и в этом виде доставляют в операционную для введения (иммунизации) или хранения при температуре 4-6°С до применения.
На четвертом этапе осуществляют введение животному водно-солевого антигена.
Ход операции
1. Подготовка к иммунизации животных. После профилактического осмотра животного с целью исключения различных заболеваний под эфирным наркозом обрабатывают одну из передних лапок животного по Филончикову-Гроссиху.
2. Введение водно-солевого антигена. Производится после предварительного тщательного ресуспендирования его с полным адъювантом Фрейнда в разведении 1:2 и неполным адъювантом Фрейнда в разведении 1:1. Затем в объеме 0,3 мл водно-солевой антиген с адъювантом Фрейнда вводится в подкожную клетчатку предварительно обработанной области. Включающий двукратное введение животному в 1 и 10 дни водно-солевого антигена и дополнительное введение животному на 15 день в том же объеме 0,3 мл, но в разведении 1:1 с неполным адъювантом Фрейнда. После подкожного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока смеси и гемостаза, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
Данное изобретение иллюстрируется следующим примером.
Для моделирования аутоиммунной язвы желудка брали крысу. После профилактического осмотра животного с целью исключения различных заболеваний под эфирным наркозом обрабатывают одну из передних лапок животного по Филончикову-Гроссиху. Затем производили после предварительного тщательного ресуспендирования его с полным адъювантом Фрейнда в разведении 1:2. Затем в объеме 0,3 мл вводили в подкожную клетчатку предварительно обработанной области. Включающий двукратное введение животному в 1 и 10 дни водно-солевого антигена и дополнительное введение животному на 15 день в том же объеме 0,3 мл, но в разведении 1:1 с неполным адъювантом Фрейнда. После подкожного введения место инъекции в течение 30 секунд умеренно прижимали асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока смеси и гемостаза, после чего обрабатывали раствором повидон-йод. Через 30-35 суток после введения антигена в указанные сроки возникала аутоиммунная язва. Макроскопически она глубокая с изрытыми неровными краями, вокруг язвы выраженный отек и гиперемия. Дно язвы покрыто некротическим детритом и фибрином (фиг.1). Гистологически язва характеризуется наличием дефекта слизистой оболочки и подслизистого слоя с выраженной инфильтрацией клеточными элементами, преимущественно лимфоцитами и нейтрофилами. Слизистая оболочка язвенного дефекта отсутствует, подлежащий подслизистый слой отечный, также имеется лимфоидная инфильтрация, ход коллагеновых волокон неупорядочен и деструктивно изменен (фиг.2).
Заявленный способ был осуществлен на 15 крысах, и был достигнут аналогичный результат.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать для создания модели экспериментальной (аутоиммунной) язвы желудка крыс, что позволяет в полном объеме и на достаточном количестве животных проводить исследования язвенного поражения желудка, протекающего с участием иммунопатологического компонента, снизить финансовые затраты на содержание животных и проводимые исследовательские работы. Также разработан водно-солевой антиген для успешного моделирования аутоиммунной язвы желудка у крыс.
1. Способ моделирования аутоиммунной язвы желудка у крыс, включающий двукратное введение животному в 1 и 10 дни водно-солевого антигена, содержащего смесь гомогената аллогенной слизистой оболочки желудка в физиологическом растворе и полного адъюванта Фрейнда, при соотношении компонентов смеси 1:2 и дополнительное введение животному на 15 день водно-солевого антигена, содержащего смесь гомогената аллогенной слизистой оболочки желудка в физиологическом растворе и неполного адъюванта Фрейнда, при соотношении компонентов смеси 1:1.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разведение гомогената аллогенной слизистой оболочки желудка в физиологическом растворе равно 1:4.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что однократное введение водно-солевого антигена как с полным, так и неполным адьювантом Фрейнда осуществляют в объеме 0,3 мл.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что водно-солевой антиген с полным и неполным адьювантом Фрейнда перед введением ресуспендируют до однородной массы.
Источник
